骨髓间充质干细胞

研究骨与软骨修复（骨折不愈合、骨质疏松症、关节炎等）和血液系统疾病（骨髓移植后造血微环境重建、再生障碍性贫血等）、免疫调节性疾病（移植物抗宿主病、自身免疫学疾病如风湿性关节/系统性红斑狼疮等）可选择骨髓间充质干细胞

肪间充质干细胞

研究软骨组织修复与再生（乳房重建面部凹陷修复、糖尿病足溃疡、烧伤等）和代谢性疾病（如胰岛素β细胞功能修复、糖尿病肾病、肥胖相关炎症调控）、抗纤维化治疗（肝纤维化、肺纤维化）、神经退行性疾病（阿尔兹海默症、帕金森病）可选择脂肪间充质干细胞

脐带间充质干细胞

研究免疫性疾病（如GVHD、系统性红斑狼疮）和神经系统损伤（脑卒中、脊髓损伤）全身性炎症（ARDS、脓毒症）可选择脐带间充质干细胞

胎盘间充质干细胞

研究母胎界面疾病（如子痫前期、复发性流产）和免疫器官移植耐受、糖尿病足溃疡可选择胎盘间充质干细胞

牙髓干细胞

研究牙周组织再生（压槽骨缺损修复）和神经退行性疾病（阿尔兹海默症）、颌面部骨再生可选择牙髓干细胞

经血间充质干细胞

研究子宫内膜修复（宫腔黏连）和卵巢早衰、缺血性心脏病等可选择经血间充质干细胞

滑膜间充质干细胞

研究软软骨缺损修复（骨关节炎）和肌腱损伤、运动系统再生可选择滑膜间充质干细胞

采集与分离

采用无菌技术获取骨髓、脂肪或脐带血干细胞，并通过流式分选确保纯度（如CD44+/CD73+/CD90+/CD105+标志物筛选）

优化分离方法（如胰酶消化、密度梯度离心、流式分选）

建立无血清、无异源成分的培养体系，减少污染风险

测试不同培养基和生长因子组合，确保高效扩增

扩增与分化

在GMP条件下进行体外扩增，并通过生长因子诱导定向分化（如成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化）

选择适合的培养基（如骨髓间充质干细胞完全培养基，脂肪间充质干细胞完全培养基，脐带间充质干细胞完全培养基，胎盘间充质干细胞完全培养基，牙髓干细胞完全培养基，滑膜间充质干细胞）

确定分化因子（如生长因子、小分子化合物）

验证分化效率（通过标志物检测，如免疫荧光、qPCR）

表面标志物检测

流式细胞术：用荧光标记的抗体标记干细胞表面抗原（如间充质干细胞MSCs的CD44+/CD73+/CD90+/CD105+，CD11b-/CD19-/CD34-/CD45-/HLA-DR-），通过流式细胞仪检测荧光信号。流式检测方法具有高通量、定量分析细胞群体纯度（如>95%符合目标表型）的优势

应用：

间充质干细胞（MSCs）

造血干细胞（HSCs）

免疫荧光/免疫组化（IF/IHC）：固定细胞后，用荧光或酶标记抗体检测表面或胞内标志物（如多能性标志物OCT4、SOX2），通过显色或荧光显微镜观察

应用：多能性验证：ESCs/iPSCs需表达OCT4、NANOG、SSEA-4

定位分析：如核内OCT4 vs 膜表面CD44

基因表达分析

实时定量PCR（qPCR）：检测多能性或谱系特异性基因（如OCT4、NANOG、LIN28），通过Ct值定量表达水平

全转录组测序（RNA-seq）：对干细胞进行高通量测序，分析基因表达谱，通过比对参考基因组，量化所有基因的表达水平

甲基化分析：通过亚硫酸盐处理DNA，检测多能性相关基因启动子甲基化状态（如OCT4、NANOG），未甲基化的启动子区允许基因表达（多能性基因在干细胞中通常低甲基化）

应用：验证iPSCs表观遗传重编程是否完全

化学因子诱导法

通过添加地塞米松、胰岛素等小分子化合物，调控细胞信号通路（如 Wnt/BMP 通路）

成脂诱导： IBMX、地塞米松、胰岛素激活 PPARγ 通路，促进脂滴积累

成骨诱导： 采用 β- 甘油磷酸盐 + 抗坏血酸 + 地塞米松，通过 Runx2/Osterix 基因激活骨基质沉积

生长因子刺激法

添加 TGF-β、IGF 等蛋白因子，刺激诱导

成软骨诱导： TGF-β3 联合 BMP-6 可促进 SOX9 表达，形成 Ⅱ 型胶原丰富的软骨基质

物理诱导法

通过力学刺激（如流体剪切力）或三维培养环境

成骨： 周期性牵张力激活 ERK1/2 通路

成软骨： 微重力环境促进细胞聚集体形成

共培养体系

与靶组织细胞共培养，通过旁分泌作用诱导分化方向

成软骨分化常与软骨细胞共培养

增殖能力评估：

细胞计数与生长曲线：定期（如每24小时）用台盼蓝染色法计数活细胞，绘制生长曲线（对数期、平台期），死细胞被染成蓝色，活细胞保持透明。通过活细胞计数计算群体倍增时间（Population Doubling Time, PDT）

CCK-8法：向培养基中加入CCK-8试剂（含WST-8），孵育后检测450 nm吸光度，吸光度与活细胞数成正比

EdU标记：将EdU加入培养基，与细胞DNA结合，通过荧光标记的叠氮化物（Click-iT反应）显色，通过荧光显微镜或流式细胞术定量增殖细胞比例

克隆形成实验：低密度接种干细胞，培养7-14天后固定染色，计数形成的大于50个细胞的克隆，反应单个干细胞的自我更新能力和增殖潜力

分化潜能评估：

验证干细胞向特定谱系（如成骨、成脂、成软骨）分化的能力

定向诱导分化实验：化学因子模拟体内微环境，激活特定信号通路，通过成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化实验，诱导分化后进行组织特异性染色或标志物表达验证分化

免疫荧光/免疫组化：分化后细胞固定，用抗体标记特定蛋白（如成骨细胞标记物Osteocalcin、成脂细胞标记物PPARγ），抗体与靶蛋白特异性结合，荧光或显色信号反映分化程度

实时定量PCR（qPCR）：提取RNA并反转录为cDNA，检测分化相关基因（如Runx2、Sox9、LPL）的表达量，通过Ct值定量基因表达水平，评估分化进程

单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对分化过程中的单个细胞进行转录组分析，揭示细胞异质性，追踪分化轨迹及关键调控基因

体外分化实验

通过特定诱导因子（如生长因子、化学小分子）刺激干细胞分化为目标细胞类型，利用免疫荧光或流式细胞术检测分化标志物（如 β-III 微管蛋白神经元标记）

体内分化实验

将干细胞移植至免疫缺陷动物（如裸鼠）体内，观察其分化为组织细胞的能力，例如通过组织切片染色验证心肌细胞特异性蛋白（如肌钙蛋白）

表面标志物检测

使用流式细胞术检测干细胞特异性表面蛋白（如 Oct4、Nanog），确认其未分化状态和多能性

克隆形成试验

通过单细胞培养评估干细胞自我更新能力，形成细胞克隆的数量反映增殖潜力

端粒酶活性检测

采用 TRAP 法测定端粒酶活性，高活性表明细胞具有持续分裂能力（如胚胎干细胞端粒酶活性高于分化细胞）

三系分化验证

定向诱导分化为外胚层（神经元）、中胚层（心肌细胞）和内胚层（肝细胞）细胞，通过形态学和标志物表达验证多能性

体内致瘤性实验

方法：将干细胞移植至免疫缺陷动物（如 NOD/SCID 小鼠）皮下或器官内，观察 6-12 个月是否形成畸胎瘤或实体瘤

原理：多能干细胞可能残留未分化细胞，通过组织病理学检测肿瘤标志物（如 Ki67、P53）评估致瘤风险

遗传稳定性检测

核型分析：G 显带技术检测染色体数目异常（如 21 三体）和结构畸变（如易位）

全基因组测序：NGS 技术筛查致癌基因（如 MYC）或抑癌基因（如 TP53）突变

免疫原性评估

MHC 分子检测：流式细胞术分析 HLA-A,B.C和HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR等 类分子表达水平，低表达可降低排斥反应

混合淋巴细胞反应：将干细胞与受体外周血淋巴细胞共培养，通过Edu掺入法测定T细胞增殖程度

细胞迁移追踪实验

活体成像：用荧光素酶标记干细胞，通过 IVIS 系统实时监测细胞在体内的迁移分布

器官特异性 PCR：提取各器官 DNA，检测干细胞特异性标记（如 Alu 序列）的归巢情况

微生物学安全检测

无菌试验：采用薄膜过滤法培养 14 天，检测细菌 / 真菌污染（如 TSB 培养基浑浊度）

内毒素检测：鲎试剂凝胶法测定内毒素含量（阈值 < 0.5 EU/mL）

表观遗传学分析

DNA 甲基化检测：焦磷酸测序评估印记基因（如 H19/IGF2）甲基化状态，异常甲基化可能导致代谢疾病

长期毒性实验

血液生化监测：定期检测 ALT/AST（肝功能）、BUN/Cr（肾功能）等指标，评估器官毒性

组织病理学：HE染色观察心脏、肝脏等器官的纤维化或炎性浸润

细胞凋亡监控

Annexin V/PI 双染：流式检测移植后细胞的凋亡比例，避免坏死细胞释放损伤相关分子（DAMPs）

细胞来源筛选

使用原代细胞（< 5 代）或经 HLA 配型的 iPSC，降低遗传突变风险（突变率 < 0.1%）

无血清培养

采用化学成分确定培养基，避免动物源成分引发免疫反应（如 α-Gal 抗原）

动态氧调控

低氧环境（5% O₂）维持干细胞干性，高氧诱导分化（Oct4 表达量差 3 倍）

自动化分选

磁珠分选（CD34 + 纯度 > 95%）或流式分选（侧群细胞占比 > 80%）确保细胞均一性

程序降温冻存

以 1℃/min 梯度降温，DMSO 冻存液保护细胞膜完整性（复苏存活率 > 90%）

三次传代检测

P3/P5/P7 代次进行支原体 PCR 检测（灵敏度 < 10 CFU）和内毒素筛查（< 0.25 EU/mL）

端粒酶监控

TRAP 法检测端粒酶活性（阈值 < 50% 永生化细胞），防止细胞恶性转化

冻存与运输

采用程序降温设备及合规冻存液，确保复苏后细胞活性≥80%

细胞溯源管理

建立三级细胞库（原始 / 主 / 工作库），每级进行STR鉴定和核型分析（分辨率>400带），防止交叉污染（ISCT 要求 STR 匹配度≥80%）

过程监控体系

代谢组学监控：检测乳酸（阈值 < 10 mM）和氨浓度（<3 mM），避免代谢废物抑制细胞增殖（倍增时间需 < 30h）

表面标志物验证：流式检测 CD34+/CD45 - 纯度（>95%）及 SSEA-4 表达量（>80%），确保干细胞特性

线粒体功能评估：JC-1 染色测膜电位（红绿荧光比 > 5），维持细胞能量代谢稳态

终产品强制检测

无菌保障：14 天培养法 + BACTEC 系统双验证，灵敏度达 1CFU/10mL

致瘤性筛查：软琼脂克隆实验（<5 个 / 10^6 细胞）联合 TP53 突变检测（ddPCR 灵敏度 0.1%）

残留物清除：ELISA 检测牛血清白蛋白（<5ng/mL）及 DNA 酶残留（活性 < 0.01U/mL）

稳定性验证

实时稳定性测试（2-8℃保存 24h 活率 > 90%）

加速试验（37℃ 6h 膜完整性 > 85%， Annexin V + 细胞 < 15%）